Zmijski otrov sadrži enzime koji hidroliziraju karboksilne esterske veze.Supstrati za hidrolizu su fosfolipidi, acetilkolin i aromatski acetat.Ti enzimi uključuju tri vrste: fosfolipazu, acetilkolinesterazu i aromatsku esterazu.Arginin esteraza u zmijskom otrovu također može hidrolizirati sintetski arginin ili lizin, ali uglavnom hidrolizira proteinske peptidne veze u prirodi, pa spada u proteaze.Enzimi o kojima se ovdje raspravlja samo djeluju na esterske supstrate i ne mogu djelovati ni na jednu peptidnu vezu.Među tim enzimima važnije su biološke funkcije acetilkolinesteraze i fosfolipaze koje su u potpunosti proučene.Neki zmijski otrovi imaju jaku aktivnost aromatske esteraze, koja može hidrolizirati p-nitrofenil etil ester, a – ili P-naftalen acetat i indol etil ester.Još uvijek je nepoznato je li ovu aktivnost proizveo neovisni enzim ili poznata nuspojava karboksilesteraze, a kamoli njen biološki značaj.Kada je otrov Agkistrodon halys Japonicus reagirao s p-nitrofenil etil esterom i indol etil esterom, nisu pronađeni hidrolizati p-nitrofenola i indol fenola;Naprotiv, ako ti esteri reagiraju sa zmijskim otrovom kobre Zhoushan podvrste i zmijskim otrovom Bungarus multicinctus, brzo će se hidrolizirati.Poznato je da ovi otrovi kobre imaju jaku aktivnost kolinesteraze, koja može biti odgovorna za hidrolizu gore navedenih supstrata.Zapravo, Mclean et al.(1971.) izvijestio je da mnogi zmijski otrovi iz obitelji Cobra mogu hidrolizirati indol etil ester, naftalen etil ester i butil naftalen ester.Ovi zmijski otrovi potječu od: kobre, crnovrate kobre, crnousne kobre, zlatne kobre, egipatske kobre, kraljevske kobre, zlatne kobre mambe, crne mambe i bijele usne mambe (D. aw još uvijek poznaje istočnu rombolastu čegrtušu
Zmijski otrov može hidrolizirati metil indol etil ester, koji je supstrat za određivanje aktivnosti kolinesteraze u serumu, ali ovaj zmijski otrov ne pokazuje aktivnost kolinesteraze.To pokazuje da u otrovu kobre postoji nepoznata esteraza, koja se razlikuje od kolinesteraze.Da bi se razumjela priroda ovog enzima, potreban je daljnji rad na razdvajanju.
1, fosfolipaza A2
(I) Pregled
Fosfolipaza je enzim koji može hidrolizirati gliceril fosfat.U prirodi postoji 5 vrsta fosfolipaze, naime fosfolipaza A2 i fosfolipaza
A. , fosfolipaza B, fosfolipaza C i fosfolipaza D. Zmijski otrov uglavnom sadrži fosfolipazu A2 (PLA2), nekoliko zmijskih otrova sadrži fosfolipazu B, a ostale fosfolipaze uglavnom se nalaze u životinjskim tkivima i bakterijama.Slika 3-11-4 prikazuje mjesto djelovanja ovih fosfolipaza na hidrolizu supstrata.
Među fosfolipazama više je proučavana PLA2.To bi mogao biti najviše proučavan enzim u zmijskom otrovu.Njegov supstrat je esterska veza na drugom položaju Sn-3-glicerofosfata.Ovaj enzim široko se nalazi u zmijskim otrovima, pčelinjim otrovima, otrovima škorpiona i životinjskim tkivima, a PLA2 ima u izobilju u zmijskim otrovima četiriju obitelji.Budući da ovaj enzim razbija crvena krvna zrnca i uzrokuje hemolizu, naziva se i "hemolizin".Neki ljudi također nazivaju PLA2 hemolitička lecitinaza.
Ludeeke je prvi otkrio da zmijski otrov može proizvesti hemolitički spoj djelovanjem na lecitin putem enzima.Kasnije su Delezenne i sur.dokazao je da kada otrov kobre djeluje na konjski serum ili žumanjak, stvara hemolitičku tvar.Danas je poznato da PLA2 može izravno djelovati na fosfolipide membrane eritrocita, uništavajući strukturu membrane eritrocita i uzrokujući izravnu hemolizu;Također može djelovati na serum ili dodani lecitin za proizvodnju hemolitičkog lecitina, koji djeluje na crvena krvna zrnca i proizvodi neizravnu hemolizu.Iako PLA2 ima u izobilju u četiri porodice zmijskih otrova, sadržaj enzima u različitim zmijskim otrovima malo je drugačiji.Čegrtuša (C
Zmijski otrov pokazao je samo slabu PLA2 aktivnost.Tablica 3-11-11 ilustrira usporedbu PLA2 aktivnosti 10 glavnih otrova zmija otrovnica u Kini.
Tablica 3-11-11 Usporedba aktivnosti fosfolipaze VIII 10 zmijskih otrova u Kini
Zmijski otrov
Oslobađanje masti
alifatska kiselina,
Cjumol/mg)
Hemolitička aktivnost CHU50/^ g * ml)
Zmijski otrov
Otpuštanje masnih kiselina
(^raol/mg)
Hemolitička aktivnost “(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
jedanaest
Micracephal ofis
pet zarez jedan nula
kalyspallas
8. 68
dvije tisuće i osam stotina
gracilis
V, akutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
tri zarez osam dva
sto četrdeset
Bnugarus fasctatus
7,56
dvjesto osamdeset
B. multicinctus
jedan zarez devet šest
dvjesto osamdeset
Viper a russelli
sedam zarez nula tri
T, mucrosquamatus
jedan zarez osam pet
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
（2） Odvajanje i pročišćavanje
Sadržaj PLA2 u zmijskom otrovu je velik, a stabilan je na toplinu, kiseline, lužine i denaturante, tako da ga je lako pročistiti i odvojiti PLA2.Uobičajena metoda je prvo provesti gel filtraciju na sirovom otrovu, zatim provesti kromatografiju ionske izmjene, a sljedeći korak se može ponoviti.Treba napomenuti da sušenje smrzavanjem PLA2 nakon kromatografije ionske izmjene ne bi trebalo uzrokovati agregaciju, jer proces sušenja smrzavanjem često povećava ionsku snagu u sustavu, što je važan čimbenik koji uzrokuje agregaciju PLA2.Uz gore navedene općenite metode, usvojene su i sljedeće metode: ① Wells et al.② Supstratni analog PLA2 korišten je kao ligand za afinitetnu kromatografiju.Ovaj se ligand može vezati za PLA2 u zmjskom otrovu s Ca2+.EDTA se uglavnom koristi kao eluens.Nakon uklanjanja Ca2+, afinitet između PLA2 i liganda se smanjuje i može se odvojiti od liganda.Drugi koriste 30% organsku otopinu ili 6mol/L uree kao eluens.③ Hidrofobna kromatografija provedena je s PheiiylSephar0SeCL-4B kako bi se uklonio trag PLA2 u kardiotoksinu.④ Protutijelo protiv PLA2 korišteno je kao ligand za izvođenje afinitetne kromatografije na PLA2.
Do sada je pročišćen veliki broj zmijskog otrova PLAZ.Tu et al.(1977.) naveli su PLA2 pročišćen iz zmijskog otrova prije 1975. Posljednjih godina, svake godine je objavljen veliki broj članaka o odvajanju i pročišćavanju PLA2.Ovdje se fokusiramo na odvajanje i pročišćavanje PLA od strane kineskih znanstvenika.
Chen Yuancong i sur.(1981.) odvojio je tri vrste PLA2 iz otrova Agkistrodon halys Pallas u Zhejiangu, koje se mogu podijeliti na kisele, neutralne i alkalne PLA2 prema njihovim izoelektričnim točkama.Po svojoj toksičnosti toksičniji je neutralni PLA2, koji je identificiran kao presinaptički neurotoksin Agkistrodotoksin.Alkalni PLA2 je manje toksičan, a kiseli PLA2 nema gotovo nikakvu toksičnost.Wu Xiangfu i sur.(1984.) usporedili su karakteristike triju PLA2, uključujući molekularnu težinu, sastav aminokiselina, N-terminal, izoelektričnu točku, toplinsku stabilnost, aktivnost enzima, toksičnost i hemolitičku aktivnost.Rezultati su pokazali da imaju sličnu molekularnu težinu i toplinsku stabilnost, ali imaju značajne razlike u drugim aspektima.S aspekta aktivnosti enzima, aktivnost kiselih enzima bila je veća od aktivnosti alkalnih enzima;Hemolitički učinak alkalnog enzima na crvene krvne stanice štakora bio je najjači, zatim neutralni enzim, a kiseli enzim teško hemoliziran.Stoga se nagađa da je hemolitički učinak PLAZ-a povezan s nabojem molekule PLA2.Zhang Jingkang i sur.(1981) napravili su kristale Agkistrodotoksina.Tu Guangliang i sur.(1983) izvijestio je da je otrovni PLA s izoelektričnom točkom 7,6 izoliran i pročišćen iz otrova Vipera rotundus iz Fujiana, a njegova fizikalna i kemijska svojstva, aminokiselinski sastav i slijed od 22 aminokiselinska ostatka na N -terminal su utvrđeni.Li Yuesheng i sur.(1985) izolirali su i pročistili još jedan PLA2 iz otrova Viper rotundus u Fujianu.Podjedinica PLA2 * je 13 800, izoelektrična točka je 10,4, a specifična aktivnost je 35/xnioI/miri mg。 Uz lecitin kao supstrat, optimalni pH enzima je 8,0, a optimalna temperatura je 65 °C LD5 ubrizgan intravenozno u miševe.Iznosi 0,5 ± 0,12 mg/kg.Ovaj enzim ima očite antikoagulantne i hemolitičke učinke.Otrovna molekula PLA2 sastoji se od 123 ostatka 18 vrsta aminokiselina.Molekula je bogata cisteinom (14), asparaginskom kiselinom (14) i glicinom (12), ali sadrži samo jedan metionin, a njen N-terminal je serinski ostatak.U usporedbi s PLA2 koji je izolirao Tuguang, molekularna težina i broj aminokiselinskih ostataka dvaju izoenzima vrlo su slični, a aminokiselinski sastav također je vrlo sličan, ali je broj ostataka asparaginske kiseline i prolina nešto drugačiji.Otrov zmije kraljevske kobre Guangxi sadrži bogat PLA2.Shu Yuyan i sur.(1989.) izolirali su PLA2 iz otrova koji ima specifičnu aktivnost 3,6 puta veću od izvornog otrova, molekularnu masu 13000, sastav od 122 aminokiselinska ostatka, izoelektričnu točku 8,9 i dobru toplinsku stabilnost.Iz promatranja učinka bazičnog PLA2 na crvene krvne stanice pomoću elektronskog mikroskopa, može se vidjeti da ima očigledan učinak na membranu crvenih krvnih stanica ljudi, ali nema očit učinak na crvene krvne stanice koza.Ovaj PLA2 ima očigledan učinak usporavanja elektroforetske brzine crvenih krvnih stanica kod ljudi, koza, zečeva i zamoraca.Chen i sur.Ovaj enzim može inhibirati agregaciju trombocita induciranu ADP-om, kolagenom i natrijevom arahidonskom kiselinom.Kada je koncentracija PLA2 10/xg/ml ~ 100 ug/ml, agregacija trombocita je potpuno inhibirana.Ako su se kao materijali koristili isprani trombociti, PLA2 ne može inhibirati agregaciju pri koncentraciji od 20 mg/ml.Aspirin je inhibitor ciklooksigenaze, koji može inhibirati učinak PLA2 na trombocite.PLA2 može inhibirati agregaciju trombocita hidrolizacijom arahidonske kiseline kako bi se sintetizirao tromboksan A2.Konformacija otopine PLA2 koju proizvodi otrov Agkistrodon halys Pallas u provinciji Zhejiang proučavana je pomoću kružnog dikroizma, fluorescencije i UV apsorpcije.Eksperimentalni rezultati pokazali su da je konformacija glavnog lanca ovog enzima slična konformaciji iste vrste enzima iz drugih vrsta i rodova, da je konformacija kostura imala dobru toplinsku otpornost, a strukturna promjena u kiselom okruženju bila je reverzibilna.Kombinacija aktivatora Ca2+ i enzima ne utječe na okruženje ostataka triptofana, dok inhibitor Zn2+ čini suprotno.Način na koji pH vrijednost otopine utječe na aktivnost enzima razlikuje se od gore navedenih reagensa.
U procesu PLA2 pročišćavanja zmijskog otrova, očiti fenomen je da zmijski otrov sadrži dva ili više PLA2 elucijskih vrhova.Ovaj se fenomen može objasniti na sljedeći način: ① zbog postojanja izoenzima;② Jedna vrsta PLA2 polimerizira se u razne smjese PLA2 s različitim molekularnim težinama, od kojih je većina u rasponu od 9 000 do 40 000;③ Kombinacija PLA2 i drugih komponenti zmijskog otrova komplicira PLA2;④ Budući da je amidna veza u PLA2 hidrolizirana, naboj se mijenja.① I ② su uobičajeni, uz samo nekoliko iznimaka, kao što je PLA2 u CrWa/w zmijskom otrovu
Postoje dvije situacije: ① i ②.Treće stanje je pronađeno u PLA2 u otrovu sljedećih zmija: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, palestinska poskok, pješčana poskok i strašna čegrtuša km。
Rezultat slučaja ④ uzrokuje promjenu brzine migracije PLA2 tijekom elektroforeze, ali sastav aminokiselina se ne mijenja.Peptidi se mogu razbiti hidrolizom, ali općenito su još uvijek međusobno povezani disulfidnim vezama.Otrov čegrtuše sadrži dva oblika PLA2, nazvana tip a i tip p PLA2.Razlika između ove dvije vrste PLA2 je samo u jednoj aminokiselini, odnosno glutamin u jednoj molekuli PLA2 zamijenjen je glutaminskom kiselinom u drugoj molekuli PLA2.Iako točan razlog ove razlike nije jasan, općenito se vjeruje da je povezana s deaminacijom PLA2.Ako se PLA2 u otrovu palestinske poskoke održava toplim s sirovim otrovom, krajnjih skupina u njegovim enzimskim molekulama postat će više nego prije.Iz C PLA2 izoliran iz zmijskog otrova ima dva različita N-terminala, a njegova molekularna težina je 30 000. Ovaj fenomen može biti uzrokovan asimetričnim dimerom PLA2, koji je sličan simetričnom dimeru koji stvara PLA2 u otrovu istočne dijamantne čegrtuše i zapadna dijamantna čegrtuša.Azijska kobra sastoji se od mnogih podvrsta, od kojih neke nisu sasvim jasne u klasifikaciji.Na primjer, ono što se nekada zvalo podvrsta Cobra Outer Caspian sada je priznata
Trebalo bi ga pripisati kobri vanjskog Kaspijskog mora.Kako postoji mnogo podvrsta i međusobno su pomiješane, sastav zmijskog otrova jako varira zbog različitih izvora, a visok je i sadržaj PLA2 izoenzima.Na primjer, otrov kobre
Najmanje 9 vrsta PLA2 izoenzima r ^ ll vrsta pronađeno je u, a 7 vrsta PLA2 izoenzima pronađeno je u otrovu podvrste kobre Caspian.Durkin i sur.(1981.) proučavali su sadržaj PLA2 i broj izoenzima u različitim zmijskim otrovima, uključujući 18 otrova kobre, 3 otrova mambe, 5 otrova poskoka, 16 otrova čegrtuše i 3 otrova morske zmije.Općenito, aktivnost PLA2 otrova kobre je visoka, s mnogo izoenzima.Aktivnost PLA2 i izozimi otrova zmija su srednji.PLA2 aktivnost otrova mambe i čegrtuše vrlo je niska ili uopće nema aktivnosti PLA2.PLA2 aktivnost otrova morske zmije također je niska.
Posljednjih godina nije objavljeno da PLA2 u zmijinom otrovu postoji u obliku aktivnog dimera, kao što je istočna rombofora čegrtuša (C. zmijski otrov sadrži tip a i tip P PLA2, a oba se sastoje od dvije identične podjedinice , a samo dimeraza ima
Aktivnost.Shen i sur.također je predložio da je samo dimer PLA2 zmijskog otrova aktivni oblik enzima.Proučavanje prostorne strukture također dokazuje da PLA2 zapadne dijamantne čegrtuše postoji u obliku dimera.Ribojedi spoj
Postoje dva različita PLA ^ Ei i E2 zmijskog otrova, u kojima 仏 postoji u obliku dimera, dimer je aktivan, a njegov disocirani monomer je neaktivan.Lu Yinghua i sur.(1980.) dalje su proučavali fizikalna i kemijska svojstva i kinetiku reakcije E. Jayanthija i sur.(1989) izolirali su osnovni PLA2 (VRVPL-V) iz otrova poskoka.Molekulska težina monomera PLA2 je 10000, koji ima letalno, antikoagulantno i edemsko djelovanje.Enzim može polimerizirati polimere različite molekulske mase pod uvjetom PH 4,8, a stupanj polimerizacije i molekularna težina polimera rastu s porastom temperature.Molekularna težina polimera generiranog na 96 °C je 53 100, a PLA2 aktivnost ovog polimera povećava se za dva
Vrijeme objave: 18. studenog 2022